کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) چیست؟

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

این فناوری که کروماتوگرافی مایع با فشار بالا نیز نامیده می شد، یک روش تحلیلی در شیمی است. HPLC یک روش کروماتوگرافی مایع است که نه تنها مواد را جدا می کند، بلکه آنها را با استفاده از استانداردها (تعیین غلظت دقیق) شناسایی و کمیت می کند. برخلاف کروماتوگرافی گازی که روش جداسازی بسیار خوبی برای مواد قابل تبخیر است، مواد غیرفرار را نیز می توان با استفاده از HPLC آنالیز کرد.

مخازن حلال

که در آن ها فاز متحرک و یا حلال ‌های شست و شو دهنده ستون ریخته شده است.

سینا صنعت اولین و تنها تولید کننده کروماتوگرافی مایع

انژکتور (Injector)

انژکتور Injector)) در واقع نقش تزریق کننده نمونه مورد آنالیز به داخل حلال عبوری را در دستگاه کروماتوگراف مایع بازی می کند. این بخش سیستمی است متشکل از چند مسیر که می تواند بین پمپ و ستون قرار گرفته و بتواند در حین عبور حلال یا فاز حامل با فشار زیاد مقدار معینی از نمونه را به داخل آن هدایت نماید. مقدار ثابت نمونه در داخل لوله ای با حجم مشخص به نام لوپ در کمین نشسته تا در لحظه فرمان کاربر سوار موج حلال شده و به سمت ستون کروماتوگرافی حرکت نماید. انژکتور اتوماتیک و یا Autosampler نیز نوع رباتیک این سیستم می باشد که می تواند تعداد بسیار زیادی از نمونه را طبق برنامه داده شده کاربر به داخل حلال تزریق نماید.

عملکرد HPLC

این یک فرآیند جداسازی کروماتوگرافی است که در آن ماده مورد بررسی از طریق یک ستون به اصطلاح جداسازی که شامل فاز ثابت همراه با یک فاز متحرک (همچنین به نام “شباع کننده” یا “شوینده” نیز نامیده می شود، پمپ می شود. یک ستون جداسازی در دستگاه HPLC بین ۱۸ تا ۳۰۰ میلی متر طول دارد و در مورد سیستم های HPLC تحلیلی عمدتاً دارای قطر داخلی ۲ تا ۴٫۶ میلی متر است. قدرت جداسازی HPLC حدود ۱۰۰ برابر بیشتر از کروماتوگرافی ستونی است.

به دلایل اقتصادی، یک فیلتر به اصطلاح پیش ستون یا فیلتر ستون اغلب در بالادست نصب می شود. این یک ستون کوتاه یا یک دیسک فیلتر است که از همان مواد ستون جداسازی ساخته شده است تا آلاینده ها را از ستون اصلی دور نگه دارد. HPLC همچنین برای خالص سازی مواد به عنوان HPLC آماده سازی (نیمه) استفاده می شود. قطر داخلی می تواند به طور قابل توجهی بزرگتر باشد، زیرا تصفیه می تواند تا مقیاس تولید انجام شود. ستون های آماده سازی برای مقیاس آزمایشگاهی دارای قطر ۱۰ یا ۲۵ میلی متر هستند.

ساختار یک دستگاه HPLC معمولی که به عناصر ضروری کاهش یافته است، در شکل زیر دیده می شود. با توجه به اصل جداسازی، بین فاز نرمال (NP)، فاز معکوس (RP)، تبادل یونی (IEC) و کروماتوگرافی حذف اندازه (SEC) و همچنین جداسازی انانتیومر (کروماتوگرافی کایرال) تمایز قائل می‌شود.

اگر یک جزء از ماده مورد بررسی به شدت با فاز ساکن تعامل داشته باشد، برای مدت نسبتا طولانی در ستون باقی می ماند. از طرف دیگر، اگر با فاز ساکن برهمکنش ضعیفی داشته باشد، زودتر از ستون خارج می شود. بسته به قدرت این فعل و انفعالات، اجزای تشکیل دهنده ماده در زمان‌های مختلف (زمان‌های ماندگاری) در انتهای ستون جداسازی ظاهر می‌شوند و سپس با یک آشکارساز مناسب می‌توان آنها را شناسایی کرد. برای فاز معکوس، زمان ماند یک ماده به زمان باقی ماندن آن در فاز ثابت (فیلم حلال در اطراف زنجیره های آلکیل سیلیکاژل اصلاح شده) بستگی دارد. مرحله ای که نرخ را تعیین می کند “انحلال” (داجذب) به فاز متحرک است.

یک فاز ثابت قطبی (به عنوان مثال سیلیکاژل / سیلیکاژل) در NP-HPLC استفاده می شود. قدرت خروجی فاز متحرک به طور کلی به قطبیت بستگی دارد. هرچه فاز متحرک قطبی تر باشد، ماده سریعتر شسته می شود. مولکول های قطبی نسبت به مولکول های غیرقطبی مدت زمان بیشتری روی ستون جذب / کند می شوند (حفظ می شوند) و بنابراین بعداً ستون را ترک می کنند. فازهای معمولی این عیب را دارند که معمولاً فقط با حلال‌های آلی می‌توان کار کرد و نه با مواد شوینده آبی. کروماتوگرافی برهمکنش هیدروفیلی (HILIC) راهی برای برون رفت از این مشکل ارائه می دهد. در HILIC، فازهای ثابت قطبی به طور مشابه با انتخاب NP استفاده می‌شوند، اما آنها به عنوان شوینده با سیستم‌های بافر آبی کار می‌کنند. با این حال، برخلاف کروماتوگرافی RP، آب قوی‌ترین ماده شوینده در HILIC است.

RP-HPLC رایج ترین روش در عمل است. حدود ۷۰ درصد از تمام جداسازی های HPLC تحلیلی جداسازی RP است. در اینجا از یک فاز ثابت غیر قطبی استفاده می شود و قدرت شستشوی فاز متحرک با افزایش قطبیت کاهش می یابد. فاز ساکن با واکنش سیلان هایی که با هیدروکربن های زنجیره بلند با سیلیکاژل جایگزین شده اند تولید می شود. سطح قطبی ذرات سیلیکاژل با یک لایه غیر قطبی از آلکان ها پوشیده شده است، یعنی قطبیت کاهش می یابد. معمولاً از مخلوط آب مقطر یا بافر و استونیتریل یا متانول به عنوان فاز متحرک استفاده می شود. در جداسازی های ایزوکراتیک، ترکیب فاز متحرک در تمام مدت یکسان باقی می ماند. در مورد جداسازی گرادیان، قطبیت مخلوط حلال در طول تجزیه و تحلیل تغییر می کند.